在柱层操作中，样品的加入方式有直接法和溶解后加入两种。选择溶解样品的溶剂应考虑极性，通常选择极性较小的，以利于成分吸附。然后逐步增加溶剂的极性，这一过程称为“梯度洗脱”，能确保吸附在层析柱上的各成分按顺序被分离。如果梯度过大，可能导致分离效果不佳。溶剂的洗脱能力可通过介电常数（ε）衡量，介电常数越高，洗脱能力越强。对于极性吸附剂如硅胶、氧化铝，通常按照极性从低到高进行洗脱；而非极性吸附剂如活性炭，其吸附顺序则相反，亲水溶剂的吸附作用通常大于脂溶性溶剂。
被分离物质的结构和性质在吸附层析中至关重要。极性成分与吸附剂的吸附强度成正比，结构差异越大，分离可能性越大。例如，中草药成分中极性基团越多，吸附力越强；碳原子数较少的极性成分吸附力更强。选择吸附剂和溶剂时，首先要考虑被分离物质的极性，如极性小的萜烯，可能需要选择吸附性强的吸附剂和弱极性溶剂。而对于极性较大的中药成分，通常选择吸附性能弱的吸附剂（如Ⅲ～Ⅳ级）和逐步增加极性的溶剂梯度。薄层层析也可用于评估分离情况。
以植物油脂为例，其由烷烃、烯烃、醇酯、甘油三酸醋和脂肪酸等组成，通过硅胶吸附后，通过一系列混合溶剂按极性顺序洗脱。对于C-27甾体皂甙元，其分离效果取决于羟基数目的差异。在氧化铝上，使用含有5%氯仿的苯进行梯度洗脱。若改用吸附性较弱的硅酸镁，洗脱剂的极性应降低，如苯或含5%氯仿的苯，可以分离出一元羟基皂甙元。这表明，同一种中草药成分在不同吸附剂上的层析，需要采用不同的溶剂来实现相同的效果，突显了吸附剂、溶剂和待分离成分之间的紧密关系。
提取分离时，用来分离极性不同的两种物质的溶剂叫做展开剂，选择适当的展开剂是首要任务。一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油醚<己烷<苯<乙醚。