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western最低上样量
做细胞
western
blot的要求及需要多少钱
答:
做
western
blot需要多少细胞并不是一个固定的值 这主要取决于蛋白的表达量,没有一个绝对的量 如果做细胞总蛋白的话,至少10的4次方细胞每微升蛋白裂解液。一般可以每泳道取10的5次方细胞每微升蛋白裂解液(即10微升
上样
) 根据这个数量级,结合western blot结果进行调整即可确认做western blot需要多少...
超详细蛋白质印迹(
Western
Blotting,WB)方法介绍
答:
提取蛋白质的每一步都需严谨对待。从预冷研磨器开始,加入含蛋白酶抑制剂的裂解液,轻轻研磨后离心,静置反应,再进行预冷离心。此时,加入蛋白
上样
缓冲液,确保比例适宜(50:1),快速而冷静地进行上样,务必参照说明书操作。精确操作的步骤如下:蛋白质上样:温度控制至关重要,务必避免高温,确保...
能根据
western
颜色深浅识别抗原性高低吗
答:
当然,如果能保证其他的条件完全一致(操作,
上样量
,所有的杂交条件等),信号值高,即条带深,则说明抗体与抗原结合的更多,识别能力更强。但是因为用
western
的方法,得需要把膜拆开分别孵育不同的抗体,一般很少用这种方法来判断抗体的亲和力,主要是比较难保证除了抗体不同,所有的条件的相对的一致性没...
科研小白的进阶之路(1)——
Western
Blot实验教程
答:
浓缩胶和分离胶分别用于将样品聚集至同一电泳起点,并按分子量大小进行分离。分离胶的浓度根据待分离蛋白的分子量选择。在电泳前,蛋白样本需加入
上样
缓冲液变性,以破坏蛋白质的二级和三级结构,确保电泳速度与分子量有关。第三步是蛋白转印。将电泳后的蛋白质转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,以便进行...
蛋白免疫印迹(
Western
Blot)详细操作步骤
答:
蛋白样本处理: 确保提取完整且无杂质,细胞或组织裂解需谨慎,使用细胞刮取、胰酶消化或组织研磨,同时加入蛋白酶抑制剂,如PMSF(1mM浓度,30min内起效,处理需在手套和实验服保护下进行)。电泳技术: 制备PAGE胶,
上样
并进行电泳,使用Marker进行分子量定位。非变性蛋白则需根据抗体特性选择适当的电泳条件...
Western
Blot实验三个常见内参选择指南:GAPDH、Tubulin还是Actin...
答:
GAPDH,作为糖酵解过程中的关键酶,分子量36kDa,表达稳定但可能在特殊条件下如缺氧、糖尿病时变化,不推荐这些情况下的内参。Actin,尤其是β-actin,作为细胞骨架蛋白,42kDa,广泛存在于真核细胞中,适合全细胞和细胞质样品标准化,但注意在
上样量
大时其线性范围问题。Tubulin,微管蛋白,55kDa,参与...
western
关于stat3的western的转膜条件,谢谢,求指教
答:
100v,1h,如果分子量比较小,转膜的时候多放点甲醇,这没什么诀窍的,如果你的蛋白丰度非常低,很难检测到,建议你的
上样量
多点,每孔放200ug,可以保障你尽可能检测到目的蛋白
【
Western
-blotting】WB实验看过来!纯干货,不忽悠!
答:
蛋白制备时,定量
上样
是关键,确保各泳道蛋白总量一致。上样前,使用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,以减少降解。蛋白变性后,通过凝胶电泳分离不同大小的蛋白,常用聚丙烯酰胺凝胶,如30% A:B液,以及Tris-甘氨酸或bis-tris缓冲体系。SDS-PAGE是最常见的分离方法,而native-PAGE保持蛋白天然状态,适合特定...
western
blot 一抗孵育,为什么不可以将一抗和分析的蛋白样品一起先孵育...
答:
一抗是完整的蛋白,如果和样品混加在一起,在样品煮沸变性时会连一抗都解链成多肽,PAGE电泳后也会变成条带啦,完全失去作用了。我倒是想过,如果我的一抗特异性非常好,能不能直接和蛋白样品孵育,再和二抗孵育,再加化学发光剂,然后取一定量的样品在酶标仪中进行分光光度测量,根据测量结果分析...
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